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    世界热讯:实现大量CAR-T细胞的高效制备,武大团队研发等渗电转手段,为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础

      原标题:实现大量CAR-T细胞的高效制备,武大团队研发等渗电转手段,为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础

      来源:DeepTech深科技

    来源:DeepTech深科技

      自 2017 年 CAR-T 细胞免疫疗法(下称“CAR-T 疗法”)被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准作为第一个用来治疗白血病的细胞疗法以来,全球已经有 8 款 CAR-T 产品获批上市。

      其中,中国国家药品监督管理局批准上市了两款,分别为奕凯达和倍诺达;FDA 批准了 6 款,分别为 Kymirah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma、Carvykti。

      这些产品可用于治疗急性淋巴白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤等恶性血液肿瘤。

      整体来看,CAR-T 疗法在治疗恶性血液病方面取得了突破性疗效,并为治疗实体瘤开辟了新的可能性。

      迄今为止,已知的所有获 FDA 批准商业化的 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)疗法,都是使用 γ- 逆转录病毒载体或慢病毒载体进行递送。

      然而,目前使用的病毒递送系统存在一些潜在限制,比如存在病毒随机嵌合基因组所带来的安全隐患、基因表达稳定性不足、免疫原性、生产成本较高等。

      为了克服这些挑战,学界正在积极研究开发非病毒递送方法,以期提高 CAR-T 疗法的治疗效果。

      其中,利用电转 CRISPR/Cas9 系统和编码 CAR的 dsDNA 模板来构建 CAR-T 疗法,是被研究得最为广泛的方法。

      但是,多支科研团队发现,电转 dsDNA 会造成严重的原代 T 细胞死亡,因此需要经过流式分选富集编辑后的活细胞,这极大限制了由非病毒递送系统构建的 CAR-T 疗法在临床上的广泛应用。

      当下,制备 CAR-T 的主要方法,是利用慢病毒递送 CAR 载体进入免疫细胞。

      截止到现在,已有 8 款由慢病毒载体制备的 CAR-T 产品进入市场。

      慢病毒制备涉及到病毒规模化生产,制造成本很高,这导致每个产品的单价都在 100-300 万不等。

      比如,2021 年 120 万一针的 CART 抗癌药就曾引起网友热议,这是一个普通家庭很难承受的价格。

      

      除此之外,当慢病毒进入细胞后,就会随机嵌入基因组之中,由于每个细胞嵌入的基因组位点均不一样,因此存在表达不均一和随机嵌入所带来的安全性风险。

      相比慢病毒载体,非病毒递送系统具有许多优势。

      非病毒递送系统包括三个成分:Cas9、gRNA、以及编码 CAR 的双链 DNA。

      通过 Cas9 和 gRNA 在基因组的特定位点切割,非病毒递送系统能将 CAR 精准整合到基因组特定位点。

      在非病毒递送过程中,由于不涉及病毒的使用,因此可以避免病毒发挥毒性。

      同时,非病毒构建 CAR-T 时所需要的 Cas9 蛋白、sgRNA、以及编码 CAR 的 DNA 模板均易制备和量产,故能极大简化 CAR-T 制备的成本和时间。

      在基因组特定位点精准嵌入 CAR,可以实现更高和更稳定的表达,这也是 CAR-T 疗法获得成功的关键因素之一。

      除此之外,使用非病毒递送 CRISPR/Cas9 构建 CAR-T,既能实现定点整合 CAR、避免随机插入的风险,又能同时调控内源性基因比如 TRAC、B2M、PD1 等。

      虽然非病毒递送更加简单高效,但是现有电转递送双链 DNA 的方法,常常伴随大量细胞毒性,这会导致免疫细胞的死亡,以至于无法高效制备 CAR-T 细胞。

      如何高效地制备大量 CAR-T 细胞

      基于此,武汉大学医学研究院教授张楹和合作者希望能够解决电转递送 DNA 所产生的细胞毒性。

      在近期一项工作中,在研究产生细胞毒性的分子机制之后,他们证明电转 DNA 诱导原代 T 细胞死亡的原因,在于激活了 cGAS-STING 通路。

    图 | 张楹(来源:张楹)

      其还发现,改变电转缓冲液的渗透压,可以调控上述通路的激活。

      利用等渗电转缓冲液可以显著降低 cGAS-STING 激活程度,进而提高 T 细胞活力。

      相较于商业电转,等渗电转制备出的 CAR-T 细胞高出 20 倍之多,从而能为非病毒递送构建 CAR-T 的临床转化研究奠定基础。

      

      除此之外,由于 T 细胞不具备调节自身细胞大小的能力,很容易受到环境渗透压影响。

      而等渗环境可以促进电转产生的膜孔融合,从而提高电转后的细胞活力和增殖。

      研究中,张楹等人通过揭示电转 DNA 导致细胞毒性的分子机制,进而寻求调控 cGAS-STING 通路的方法,最终降低细胞的毒性。

      他们发现电转 DNA 导致的细胞毒性,是源于激活了细胞内的天然免疫通路 cGAS-STING。

      由于 STING 的小分子抑制剂和 siRNA 均存在自身局限性,无法有效恢复电转 DNA 所来带的细胞毒性。

      于是,他们另辟蹊径从电转入手,利用高通量筛选来提高 DNA 递送效率和细胞活力的缓冲液。

      在筛选几百种电转条件之后,课题组发现电转缓冲液 B1mix 可以显著降低 cGAS-STING 通路的激活,从而提高 DNA 的递送效率和细胞活力。

      进一步地,他们又对电转机制进行研究,结果发现电转缓冲液的渗透压,可以直接调控 cGAS 与 dsDNA 的结合亲和力,进而调节 cGAS-STING 激活。

      与此同时,等渗电转缓冲液可以极大降低上述通路的激活和细胞死亡,从而实现 CAR-T 细胞的高效制备。

      事实上,电转递送是一个很成熟的领域,针对它的相关研究主要集中在 20 世纪 90 年代以前。

      而该团队通过在成熟领域里寻找创新点,揭示了电转缓冲液的渗透压可以调控细胞内的分子互作作用。

      其还证明通过改变电转缓冲液可以显著提高 CAR-T 制备,在机制上揭示了渗透压这一影响递送的关键因素,为调控 cGAS-STING 通路的激活打开了新思路。

      此外,在造血干细胞以及小鼠 T 细胞中,这种新的电转方法均能提高它们的递送效率,这对于其他领域的研究也非常有价值。

      

      三次补充实验与上百种电转缓冲液

      据介绍,论文从第一次投稿到接收,前后累计补充 3 次实验。

      每一次审稿人的意见都会给他们带来不同的启发。

      在第一轮审稿意见中,两位审稿人都提出同一个问题:新电转缓冲液促进 DNA 入核的机制是什么?

      为回答这个问题,课题组解析了电转过程中的每一个步骤,并从不同的角度去研究,比如膜融合过程、电转缓冲液的成分、理化性质等。

      为了探索是否存在某种成分直接影响 DNA 递送,他们将电转缓冲液的成分进行逐一删减或逐一增加,借此配制成新的电转缓冲液。

      张楹表示:“这是一个巨大的工作量,我们前后一共试了上百种电转缓冲液,最终发现电转缓冲液的渗透压起着至关重要的作用,与具体的成分无关。

      ”

    (来源:Nature Biomedical Engineering

      论文发表后,课题组收到来自业界的大量咨询,目前他们正和业界积极合作探索转化的可能。

      细胞治疗产业蓬勃发展,据估计到 2030 年全球细胞产业可以达 600 亿美金。

      截止到 2022 年,已有 57 项基因编辑的细胞疗法进入临床实验,包括肿瘤免疫(38 项)、地中海贫血症(15 项)和糖尿病(4 项)。

      这些细胞疗法可以通过电转递送基因编辑工具,通过增强细胞功能达到疾病的治疗。

      而本次的电转方法不仅可以提高 DNA 递送效率,也可以在多种原代细胞中提高 mRNA 和蛋白的递送效率,因而在细胞治疗领域有着极大的应用前景。

      利用这一递送方法,在降低原料用量的同时,并不会影响递送的效率和稳定性,这能助力于实现降本增效,进一步推动细胞治疗产业的发展。

      

      同时,本次研究还发现电转缓冲液除能提高 DNA 递送效率之外,对于 mRNA 和蛋白的递送效率也可以显著提高。

      后续,他们将继续改进配方,希望能在现有基础之上将 mRNA 的递送效率再次提高 2-4 倍。

      同时,他们也正在开展机制解析,以期可以解决 mRNA 递送的问题。

      1. An, J., Zhang, CP., Qiu, HY. et al. Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS–STING pathway. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01073-7

      运营/排版:何晨龙

      本文《实现大量CAR-T细胞的高效制备,武大团队研发等渗电转手段,为非病毒递送构建CAR-T的临床转化奠定基础》介绍到此结束,感谢阅读。

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